Autor:

admin

Data publikacji:

30.09.2019

zaloguj się, żeby móc oceniać artykuły

Rozwój zarodka w trakcie zapłodnienia „in vitro” oraz wybór zarodka do transferu

in vitro

Spis treści:

 

Etap 1. Pobranie komórek jajowych

Podczas punkcji jajników pobierany jest płyn pęcherzykowy, zawierający komórki jajowe (oocyty) – każdy pęcherzyk jajnikowy powinien zawierać jeden oocyt (choć może zdarzyć się, że nie zawiera żadnego). Płyn pobierany jest do przygotowanych i oznaczonych nazwiskiem pacjentki probówek, a następnie przekazywany jest do laboratorium embriologicznego. Kumulus (łac. cumulus oophorus lub ang. cumulus – corona – complex), czyli kompleks utworzony przez komórkę jajową o średnicy ok. 0,12 mm wraz z otaczającym ją wzgórkiem jajonośnym (warstwą komórek ziarnistych tworzących tzw. wieniec promienisty (łac. corona radiata) odżywiających oocyt), jest dobrze widoczny gołym okiem.

Wzgórek jajonośny

Embriolog wyszukuje wszystkie wzgórki jajonośne, które zawierają komórki jajowe obecne w pobranym płynie i pod mikroskopem ocenia pośrednio ich dojrzałość.

wzgórki jajonośne
niedojrzałe komórki jajowe

Niedojrzałe komórki jajowe razem z warstwą komórek ziarnistych (tzw. kumulusy)

Dojrzałe oocyty przygotowywane są do zapłodnienia poprzez umieszczenie w kropli pożywki w plastikowej szalce laboratoryjnej w inkubatorze (o odpowiednio dobranych warunkach atmosferycznych i temperaturze zbliżonej do temperatury ludzkiego ciała).

dojrzałe komórki jajowe

Dojrzałe komórki jajowe razem z warstwą komórek ziarnistych

W przypadku procedury IVM (ang. in vitro maturation), tj. dojrzewania w warunkach laboratoryjnych, pobiera się niedojrzałe komórki jajowe w cyklach niestymulowanych lub nieznacznie stymulowanych, oocyty te dojrzewają w laboratorium w czasie od 24 do 48 godzin od punkcji jajników.

Podczas klasycznego zapłodnienia pozaustrojowego IVF (ang. in vitro fertilization) oocyty wraz z otaczającymi je komórkami ziarnistymi umieszczane są w szalce, w kropli płynnej odżywki i czekają na przygotowane nasienie. Do zapłodnienia metodą ICSI (ang. intracytoplasmic sperm injection), czyli docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika, komórki jajowe są dodatkowo tuż przed zapłodnieniem oczyszczane z warstwy komórek ziarnistych. Dojrzała komórka jajowa po usunięciu warstwy komórek ziarnistych wygląda tak:

dojrzała komórka jajowa

Dojrzała komórka jajowa

Etap 2. Nasienie

W tym samym czasie, gdy trwa preparatyka komórek jajowych, mężczyzna oddaje nasienie, które jest przygotowywane do zapłodnienia – plemniki są oddzielane od plazmy nasienia poprzez wirowanie w specjalnych odżywkach o różnych stężeniach, które działają jak filtr. W szczególnych przypadkach, np. gdy plemników w nasieniu jest bardzo mało lub spodziewane są trudności w oddaniu nasienia w dniu punkcji jajników, mężczyzna oddaje nasienie wcześniej i jest ono zamrażane. Jeśli w nasieniu nie ma plemników, a zachowana jest spermatogeneza (proces wytwarzania plemników) można ich szukać w tkance najądrza (PESA, ang. percutaneous epididymal sperm aspiration) lub jądra (TESE, ang. testicular sperm extraction, M–TESE, ang. micro–testicular sperm extraction). Zabieg pobrania aspiratu z najądrza lub tkanki jądrowej (biopsja jądra) wykonywany jest w znieczuleniu ogólnym – narkozie i najczęściej odbywa się wcześniej (przed punkcją jajników pacjentki), a zamrożony materiał po ocenie histopatologicznej przechowywany jest do wykorzystania, czyli zapładniania komórek jajowych w dniu ich pobrania. Rozmrażane są wtedy kolejno poszczególne porcje aspiratu lub bioptatu jądra, w których embriolog poszukuje żywych plemników, które mogą być użyte do zapłodnienia oocytów; zdarza się, że poszukiwanie prawidłowych plemników trwa wiele godzin. Do zapłodnienia jednej komórki jajowej metodą ICSI potrzebny jest jeden zdolny do zapłodnienia plemnik, tak więc współczesna medycyna daje szansę na biologiczne ojcostwo mężczyznom ze skrajnieograniczoną płodnością.

Etap 3. Zapłodnienie

Klasyczne zapłodnienie pozaustrojowe (IVF) polega na umieszczeniu w tej samej szalce laboratoryjnej komórek jajowych i odpowiedniej liczby plemników – przyjmuje się, że na jedną komórkę jajową dodaje się 50–100 tys. wyselekcjonowanych plemników. Plemniki samodzielnie docierają do komórki jajowej, a jeden z nich sam wnika do jej wnętrza. Po wniknięciu błona komórkowa komórki jajowej robi się nieprzepuszczalna dla pozostałych plemników, „broniąc się” przed tzw. polispermią, czyli nieprawidłowym zapłodnieniem przez więcej niż jeden plemnik.

ICSI

ICSI

W procedurze IMSI (ang. Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection) plemnik jest wybierany pod dużym powiększeniem optycznym, pod którym widać więcej szczegółów jego budowy i możliwa jest użycie do zapłodnienienia plemnika o budowie najbardziej zbliżonej do opisywanego przez zwolenników metody ideału; niestety nie przekłada się to na większą skuteczność zabiegu.

IMSI
imsi2

IMSI

Komórki jajowe po zapłodnieniu przenoszone są do specjalistycznych pożywek i umieszczane w inkubatorach, gdzie utrzymywana jest stała temperatura, wilgotność oraz stężenie CO2. Standardowo raz dziennie zarodki są oglądane pod mikroskopem; takich ocen z reguły nie wykonuje się częściej,  ponieważ należy unikać narażania zarodków na zmianę warunków środowiska, w którym się rozwijają. 

Oceny, którym poddawane są zarodki mają na celu określenie ich potencjału rozwojowego. Embriolog obserwuje tempo i sekwencję podziału komórek, ich wielkość i wygląd oraz stopień fragmentacji.

Alternatywą dla klasycznych inkubatorów są embrioskopy. To inkubatory, które umożliwiają ciągłą obserwację zarodków bez konieczności wyjmowania ich i przenoszenia pod mikroskop. Kamera umieszczona jest wewnątrz inkubatora i co 15–20 minut wykonuje pojedyncze zdjęcia zarodkom. Zdjęcia gromadzone są przez komputer, co pozwala na uzyskanie szczegółowego zapisu obejmującego cały okres hodowli zarodków (tzw. zdjęcia poklatkowe – ang. time lapse).

Etap 4. Rozwój zarodka

Po 16–18 godzinach od wniknięcia plemnika do komórki jajowej można zaobserwować cechy zapłodnienia. Prawidłowo zapłodniona komórka jajowa ma widoczne dwa przedjądrza (ang. pronucleus) – 2PN, a w nich wyraźne, symetrycznie ułożone ciałka prekursorowe jąderek (NPB, ang. nucleolar precursor body) oraz dwa ciałka kierunkowe (pierwsze ciałko kierunkowe posiada dojrzała komórka jajowa, drugie zostaje wyrzucone w ok. 4 godziny po wniknięciu plemnika).

zapłodnione komórki

3 prawidłowo zapłodnione komórki jajowe (2PN), 1 komórka (górna) zapłodniona nieprawidłowo (1PN)

W warunkach prawidłowych można się spodziewać, że prawidłowo zapłodni się powyżej 60% komórek po konwencjonalnym zabiegu zapłodnienia pozaustrojowego (IVF), a po ICSI powyżej 65%. Ryzyko kompletnego braku zapłodnienia wynosi ok.5%.

W przypadku prawidłowo zapłodnionych komórek jajowych po około 26–28 godzinach następuje pierwszy podział, a zarodek przyjmuje postać dwukomórkową.

zarodek 2komórkowy

Zarodek 2-u komórkowy

43–45 godzin od zapłodnienia zarodek po kolejnych podziałach ma już cztery komórki potomne, czyli blastomery. Choć komórki zarodka dzielą się symetrycznie, jednak nie musi to nastąpić idealnie w tym samym momencie, dlatego czasem widujemy zarodki o nieparzystej liczbie blastomerów.

zarodek 3 kom
zarodek 4 kom

zarodek 3-o komórkowy                                           zarodek 4-o komórkowy

Po kolejnej dobie (67–69 godzin po zapłodnieniu) zarodek powinien mieć osiem komórek potomnych.

zarodek 8 kom

Zarodek 8-o komórkowy

W drugiej lub trzeciej dobie od zapłodnienia zarodek może być przeniesiony (transferowany) do macicy.

W czwartej dobie po IVF/ICSI zarodek ma już za sobą wiele podziałów komórkowych i z wyglądu przypomina owoc morwy, dlatego nazywany jest morulą. Liczba pojedynczych komórek jest trudna do oceny, w dobrej jakościowo moruli jest ich 16–32 i są skompaktowane, czyli granice między komórkami zanikają. Etap moruli, inaczej zarodka kompaktującego, osiąga tylko ok. 20–40% zarodków.

morula

Morula, zarodek 4-o dniowy

W piątym, a najdalej w szóstym dniu hodowli zarodek powinien osiągnąć stadium blastocysty. Na tym etapie część komórek grupuje się, tworząc wyraźny węzeł zarodkowy, z którego powstanie kiedyś dziecko, a część utworzy pojedynczą warstwę komórek na obwodzie zarodka (trofoektoderma), z której ukształtuje się łożysko. Cały zarodek znacznie się powiększa, a między węzłem zarodkowym a trofektodermą pojawia się płyn. Otoczka przejrzysta staje się bardzo cienka, a pod koniec piątego dnia rozwoju odcinkowo zanika i zarodek w stadium blastocysty zaczyna się z niej wydostawać, czyli „wykluwać się”. Jest to ostatni etap rozwoju, do którego zarodki są hodowane w laboratorium.

blastocysta 5 dni

Blastocysta, zarodek 5-o dniowy

W ciągu kolejnych 1–2 dni zarodki wyklują się z otaczającej błony i zaczną zagnieżdżać (implantować) w błonie śluzowej macicy.

blastocysta wykluwająca się

Blastocysta „wykluwająca się”

Ocena rozwoju zarodków (za: Standardy oceny komórek jajowych i zarodków - rekomendacje PTMRiE dla laboratoriów wspomaganego rozrodu)

Dla celów prognostycznych oraz statystycznych zarodki są oceniane w odstępach sekwencyjnych.

Embriolog ocenia:

1. Postęp w dzieleniu się komórek i czas podziału. Za wzorcowe określa się podziały komórkowe odbywające się w poniższych okresach:

  • dzień 2. hodowli: 44 ± 1 godz., oczekiwany zarodek 4–blastomerowy,
  • dzień 3. hodowli: 68 ± 1 godz., oczekiwany zarodek 8–blastomerowy,
  • dzień 4. hodowli: 92 ± 1 godz., oczekiwany zarodek w stadium moruli,
  • dzień 5. hodowli: 116 ± 2 godz., oczekiwana blastocysta.

Fragmentację, czyli obecność drobnych struktur cytoplazmatycznych pozbawionych DNA, które nie są częścią blastomerów, a powstają podczas kolejnych podziałów komórkowych. Fragmentacja w ludzkich zarodkach jest bardzo powszechnym zjawiskiem – dotyczy nawet 75% zarodków. Jej przyczyna jest nieznana, podejrzewa się, że może być skutkiem tzw. apoptozy, czyli programowanej śmierci komórki. Stopień fragmentacji zazwyczaj koreluje z potencjałem rozwojowym zarodka – poważna fragmentacja zaburza rozwój zarodka i źle rokuje co do jego dalszego potencjału rozwojowego i zagnieżdżenia w macicy, łagodna fragmentacja zazwyczaj nie ma wpływu na rozwój, a niektórzy badacze uważają, że może nawet dobrze rokować. Fragmentację ocenia się w zarodkach w stadium tzw. podziałowym, czyli do 3. dnia rozwoju. Ocenia się ją jako odsetek całej objętości zarodka, i wyróżnia się następujący stopień fragmentacji:

  • łagodny – <10%,

    łagodny

    • średni – 10–25%,

    średni

    • duży – >25%.

    duży

    2. Zarodki 5–dniowe, czyli blastocysty ocenia się według systemu Gardnera i Schoolcrafta.

    Ocenia się:

    • stopień ekspansji blastocysty, czyli wielkość jamy, która w tym czasie powstaje w zarodku; skala 1–6:

    stopień ekspansji blastocysty

    • węzeł zarodkowy (ICM, ang. inner cell mass);
      skala A–C lub 1–3:
      A (lub 1) – wiele komórek, ściśle ułożonych,
      B (lub 2) – kilka komórek, luźno ułożonych,
      C (lub 3) – bardzo mało komórek.
    • trofektoderma (TE); skala A–C lub 1–3:
      A (lub 1) – wiele komórek, ściśle ułożonych nabłonkowo,
      B (lub 2) – kilka komórek, luźno ułożonych nabłonkowo,
      C (lub 3) – bardzo mało dużych komórek.

    Zarodki najwyższej jakości – TQ (ang. top quality), to zarodki o najbardziej oczekiwanej budowie morfologicznej i podziałach odbywających się w odpowiednich sekwencjach, przy czym pod uwagę bierze się oceny z 2., 3., 4.i 5. dnia rozwoju. W przypadku blastocyst najlepiej rokują zarodki, które mają jak największy stopień rozprężenia (3 i powyżej) i jednocześnie węzeł oraz trofektodermę określane jako A (albo 1) lub B (albo 2).

    Należy podkreślić, że ocena zarodków jest tylko przybliżoną oceną ich potencjału rozwojowego i ani nie gwarantuje, ani nie przekreśla szansy na ciążę i narodziny dziecka. Zarodek, który nie jest idealny może również zapoczątkować ciążę i pozwolić na narodziny zdrowego dziecka – wiele takich przypadków obserwowaliśmy w Przychodni nOvum.

    Film nr 3 rozwój zarodka do stadium balstocysty

    Etap 5. Przygotowanie zarodków do transferu

    Transfer przeprowadzić można w każdym dniu wczesnego rozwoju zarodka, ale zazwyczaj robi się to w 2., 3. lub 5. dobie po punkcji. Decyzja o tym, w którym dniu podać zarodki do macicy zależy od wielu czynników medycznych i embriologicznych. Jeśli w wyniku zabiegu zapłodnienia pozaustrojowego powstał tylko jeden zarodek, szczególnie u pacjentek w zaawansowanym prokreacyjnym wieku, wówczas nie ma powodu, żeby przedłużać jego hodowlę w warunkach in vitro, podaje się go zazwyczaj w 2. lub 3. dobie. Jeśli zarodków powstało kilka, wtedy ich hodowla do 5. doby pozwoli wybrać te, które mają największe szanse na zagnieżdżenie. W dniu transferu zarodki podlegają ostatecznej ocenie embriologicznej. Najlepiej rokujący (zazwyczaj jeden lub maksymalnie dwa) jest przygotowywany do bezpośredniego (tzw. „świeżego”) transferu. W nOvum tuż przed transferem wybrany zarodek jest pokazywany pacjentom na ekranie w gabinecie transferowym. Jest to obraz przekazywany z laboratorium embriologicznego spod mikroskopu, jednocześnie embriolog opisuje i wyjaśnia szczegóły wyglądu zarodka oraz jego klasyfikację. Wybrany zarodek jest umieszczany w cienkim plastikowym cewniku wraz z małą objętością płynu hodowlanego i pod kontrolą ultrasonografu podawany do jamy macicy. W trakcie zabiegu para może obserwować na ekranie ultrasonografu przesuwanie się płynu z pęcherzykami powietrza znakującymi miejsce umieszczenia zarodka. W większości klinik para otrzymuje zdjęcie transferowanych zarodków.

    W szczególnych wypadkach bezpośrednio przed transferem można wykonać nacięcie otoczki przejrzystej (mechanicznie, laserowo lub chemicznie), co może w niektórych przypadkach wspomagać jego „wykluwanie się ” z otoczki przejrzystej (AH, ang. assisted hatching) i ułatwić zagnieżdżenie w macicy. Jednak w metaanalizie Cochranowskiej, badającej skuteczność AH na podstawie 31. randomizowanych badań klinicznych, w których brało udział 5728 pacjentek nie potwierdzono statystycznie większej liczby urodzonych dzieci po AH w porównaniu do pacjentek, u których AH nie było wykonywane.

    Nawet przy podaniu jednego zarodka może dojść do jego podziału na dwa i powstania ciąży bliźniaczej jednojajowej.

    Ryzyko powstania bliźniąt jednojajowych (monozygotycznych) wynosi:

    • w ciąży naturalnej 0,25–0,5%,
    • po zabiegu zapłodnienia in vitro (średnio) 2%, w tym:
    • po transferze zarodka 5–dniowego (blastocysty) 2,6%,
    • po transferze zarodka na wcześniejszym etapie rozwoju 1,2%

    Okazuje się, że AH, mimo wcześniejszych obaw, nie wpływa na wzrost tego ryzyka – liczba bliźniąt monozygotycznych po tym zabiegu wynosi ok. 1,1%. Ryzyko podziału zarodka po kriotransferze wynosi 0,8%.[7,8]

    Etap 6. Kriokonserwacja

    Dziś już nikt nie ma wątpliwości, że możliwość przechowywania komórek oraz tkanek rozrodczych i zarodków jest nieodłącznym elementem procedury in vitro. Współcześnie w codziennej praktyce stosowane są dwie metody kriokonserwacji – powolne mrożenie (ang. slow freezing) oraz coraz częściej stosowana witryfikacja, która polega na bardzo szybkim mrożeniu w bardzo małej objętości płynu. Decyzja o zastosowaniu najlepszej możliwej opcji należy zawsze do kriobiologa zajmującego się tą procedurą, który stosuje metodę najskuteczniejszą w danej sytuacji.

    Plemniki, tkanka jądra (bioptat) lub aspirat z najądrza są poddawane kriokonserwacji w przypadkach, gdy:

    • partner ma trudności w oddawaniu nasienia i istnieje ryzyko, że nie będzie mógł oddać nasienia w dniu punkcji jajników partnerki;
    • w nasieniu jest mała liczba plemników i istnieje ryzyko, że plemników z jednej porcji oddanego nasienia będzie mniej niż komórek jajowych do zapłodnienia, wtedy potrzebna jest więcej niż jedna próbka nasienia;
    • plemniki będą pozyskiwane z aspiratu lub tkanki pobranej podczas zabiegów PESA, TESE, M-TESE, które wykonuje się wcześniej w trybie planowym, aby wykonać badanie histopatologiczne, żeby wykluczyć poważne choroby i aby mieć większą pewność, że plemniki uda się pozyskać zanim partnerka pacjenta zostanie poddana punkcji jajników;
    • nasienie jest zabezpieczane do późniejszego wykorzystania przed rozpoczęciem leczenia onkologicznego mężczyzny (ang. oncofertility).

    Komórki jajowe, tkanka jajnikowa są zabezpieczane, gdy:

    • pobrano więcej komórek jajowych niż zgodnie z obowiązującym prawem można zapłodnić, zamrożone komórki pozostają do wykorzystania w kolejnych cyklach leczenia;
    • pacjentka podejmuje decyzję o przekazaniu części swoich komórek innej, niepłodnej parze;
    • komórki jajowe lub tkanka jajnikowa jest zabezpieczana przed rozpoczęciem leczenia onkologicznego kobiety (ang. oncofertility) do późniejszego wykorzystania.

    Zarodki są poddawane kriokonserwacji, gdy:

    • powstanie ich więcej niż można podać w trakcie pierwszego tzw. „świeżego” transferu i zostaną przechowywane do wykorzystania w przypadku niepowodzenia pierwszego transferu lub gdy para po urodzeniu pierwszego dziecka będzie starała się o kolejne;
    • kobieta z powodów losowych (np. wypadek) nie może przyjechać do ośrodka w dniu zaplanowanego transferu oraz gdy jej stan zdrowia nie pozwala na wykonanie transferu lub transfer w aktualnym stanie zdrowia pacjentki negatywnie wpłynąłby na potencjał rozwojowy zarodków lub przebieg ciąży;
    • gdy kobieta w wyniku stymulacji jajników zagrożona jest zespołem przestymulowania jajników (OHSS, ang. oviarian hiperstimulation syndrome), w takiej sytuacji podanie zarodków i ciąża mogłyby nasilić ten zespół i pogorszyć stan zdrowia pacjentki, dlatego wówczas wszystkie zarodki są zamrażone i podawane podczas kolejnych cykli, gdy ryzyko zupełnie minie.

    Kriokonserwacja zarodków jest jedyną metodą zabezpieczenia ich przetrwania poza organizmem kobiety. Zarodki dobrze tolerują kriokonserwację, a współcześnie mamy coraz więcej doniesień o ciążach i porodach po kilkunastu, a nawet ponad dwudziestu latach ich przechowywania[9]. Coraz więcej też jest publikacji sugerujących wyższość kriotransferów nad transferami wykonywanymi bezpośrednio w cyklu stymulowanym. Ma to swoje biologiczne uzasadnienie – „świeży” transfer odbywa się w cyklu, w którym organizm kobiety poddawany był intensywnej stymulacji hormonalnej, co może niekorzystnie wpływać na śluzówkę macicy podczas implantacji, zaś do kriotransferu kobieta może podejść w cyklu, w którym jest zachowany jego naturalny rytm i wydzielanie hormonalne.

    Kriotransfer ostatniego zarodka to z punktu widzenia skuteczności leczenia i jakości pracy laboratorium embriologicznego moment zakończenia pełnego cyklu in vitro, dlatego pary rozpoczynające leczenie powinny z uwagą zapoznać się z doświadczeniem wybranego ośrodka w zakresie kriokonserwacji i tzw. kumulacyjnego odsetka ciąż i porodów.

    Wszystkim Państwu życzę powodzenia w leczeniu i jak najszybszego powiększenia rodziny!

    lek. Katarzyna Kozioł - Senior Clinical Embryologist ESHRE
    Dyrektor ds. Medycznych Przychodni Lekarskiej nOvum
    Prezes Polskiego Towarzystwa Medycyny Rozrodu i Embriologii

    Piśmiennictwo:

    1. Standardy oceny komórek jajowych i zarodków - rekomendacje PTMRiE dla laboratoriów wspomaganego rozrodu, Liss J.et al
    2. In vitro fertilization (3rd edition) Elder and Dale, Cambridge University Press, 2011
    3. Atlas of Human Embryology: from Oocytes to Preimplantation Embryos, M. Cristina Magli, Gayle M. Jones, Kersti Lundin, Etienne Van den Abbeel, Human Reproduction Vol. 27, Suppl. 1, 2012
    4. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting, Human Reproduction, Vol.26, No.6 pp. 1270–1283, 2011
    5. The Vienna consensus: report of an expert meeting on the development of art laboratory performance indicators Human Reproduction Open, Volume 2017, Issue 2, 12 July 2017, hox011,
    6. Fragmentation of human cleavage-stage embryos is related to the progression through meiotic and mitotic cell cycles, Mette Haug Stensen, M.Sc.,et al., Fertility and Sterility,2014
    7. Monozygotic twinning: an eight-year experience at a large IVF center Jaime Knopman, M.D. Lewis C. Krey, Ph.D.New York University Fertility Center, New York University–Langone Medical Center, New York, New York le Fertil Steril July 2010 Volume 94, Issue 2, Pages 502–510
    8. What makes them split? Identifying risk factors that lead to monozygotic twins after in vitro fertilization.Knopman JM1, Krey LC2, Oh C2, Lee J2, McCaffrey C2, Noyes N2. Fertil Steril. 2014 Jul;102(1):82-9. doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.03.039. Epub 2014 Apr 29.
    9. Children born from frozen embryos stored for 10 years -- analysis of 5 cases, Papis K, Lewandowski P, Wolski JK, Kozioł K, Ginekol Pol. 2013 Nov;84(11):970-3
    10. Gardner DK, Schoolcraft WB. In vitro culture of human blastocysts. In Jansen R, Mortimer D (eds). Toward Reproductive Certainty: Fertility and Genetics Beyond 1999. London: Parthenon Publishing 1999a,378–388.