Nowe metody w leczeniu niepłodności męskiej

Temat: 
Wiadomości ze świata, prasy itp.

Nowe metody w leczeniu niepłodności męskiej
 
Waldemar Kuczyński1, 2, Grzegorz Mrugacz2, Sławomir Wołczyński1, Tadeusz Wasilewski2, Robert Czech2, Marian Szamatowicz1
 
1 z Instytutu Położnictwa i Chorób Kobiecych Akademii Medycznej w BiałymstokuDyrektor Instytutu: prof. dr hab. n. med. Marian Szamatowicz2 KRIOBANK, Centrum Leczenia Niepłodności MałżeńskiejKierownik Centrum: doc. dr hab. n. med. Waldemar Kuczyński
 
Klasyczne techniki wspomaganego rozrodu (ART) zastosowane w leczeniu niepłodności małżeńskiej uwarunkowanej czynnikiem męskim pozwalały uzyskać ciąże tylko w niewielkim odsetku leczonych par.
>>>
Wiązało się to głównie ze stopniem upośledzenia jakości nasienia, jednak nawet w grupach pacjentów o niewielkim obniżeniu potencjału rozrodczego mężczyzn całkowity brak zapłodnień (TFF) miał miejsce u ponad jednej trzeciej par leczonych klasyczną metodą pozaustrojowego zapłodnienia (IVF-ET). Znaczna liczba pacjentów z ciężką oligo-, astheno-, teratozoospermią czy też niepłodnością immunologiczną, nie mogła liczyć na skuteczne leczenie standardowymi metodami ART. W chwili obecnej można stwierdzić, że problem niepłodności męskiej w sensie uzyskania potomstwa przestał istnieć. Jedynie około 3% mężczyzn, uważanych za niepłodnych w rzeczywistości nie ma szansy na posiadanie własnego potomstwa. Stało się tak za sprawą wprowadzenia technik mikrochirurgicznego zapłodnienia komórki jajowej tzw. microassisted fertilization (MAF). Techniki mikromanipulacyjne dokonywane na gametach mają na celu ułatwienie syngamii poprzez mechaniczne lub chemiczne przerwanie ciągłości osłonki przejrzystej (PZD) oraz wprowadzenie plemników do przestrzeni okołożółtkowej (SUZI), bądź pojedynczego plemnika do cytoplazmy komórki jajowej (ICSI).

Najprostszą z mikrochirurgicznych technik zapłodnienia jest przerwanie ciągłości osłonki przejrzystej oocytu (partial zona dissection – PZD). W przypadkach ograniczonej zdolności zapładniającej męskich komórek płciowych, w szczególności związanych z oligospermią, asthenospermią oraz brakiem wiązania plemników z osłonką przejrzystą, otwarcie przestrzeni okołożółtkowej umożliwia wniknięcie do niej plemników oraz fuzję z oolemmą, a w konsekwencji – zapłodnienie. Zasadniczym mankamentem metody jest jednak wysoki odsetek komórek zapłodnionych polispermicznie oraz wysoka częstość braku zapłodnień.
Bardziej zaawansowaną techniką jest podotoczkowe wstrzyknięcie plemników (subzonal sperm insertion – SUZI). Zabieg ten polega na wprowadzeniu pod osłonkę przejrzystą oocytu kilku lub kilkunastu, skapacytowanych plemników. Metoda ta umożliwia uzyskanie ciąży w 19% leczonych par. Wyniki te są zbliżone do uzyskiwanych w warunkach IVF-ET u pacjentek z czynnikiem jajowodowym. Skuteczność metody ograniczona jest przede wszystkim wysokim, sięgającym bowiem aż 50% odsetkiem oocytów zapłodnionych polispermicznie. Obie wymienione metody, wymagają prawidłowo przebiegającej fuzji błon komórkowych plemnika i komórki jajowej z następową jej aktywacją.
Opisane metody straciły obecnie znaczenie praktyczne wobec zdecydowanie korzystniejszych wyników uzyskiwanych za pomocą bardziej radykalnych technik mikrochirurgicznych. Metodą taką, jest docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (intracytoplasmic sperm injection – ICSI). Wskazania do leczenia tą metodą mają miejsce gdy:
1. Liczba plemników jest mniejsza od wymaganego minimum, niezbędnego do leczenia standardową techniką IVF (np.: mniej niż 500 000),
2. Poprzednie próby leczenia standardową metodą IVF, zakończone zostały brakiem zapłodnień oocytów,
3. Odsetek zapłodnionych komórek jajowych w poprzednich próbach był niższy od 20%,
4. Stwierdza się przeciwciała przeciwplemnikowe (niepłodność immunologiczna).
Leczenie tą metodą nie różni się od pozaustrojowego zapłodnienia w zakresie takich procedur, jak: kontrolowana hiperstymulacja jajników i jej monitorowanie, pobranie oocytów, transfer zarodków, czy też substytucja drugiej fazy. Jedynie proces zapłodnienia odbywający się w standardowym programie IVF w sposób samoistny zastąpiony został mikrochirurgicznym wprowadzeniem plemnika do ooplazmy. Przeprowadzenie tego zabiegu możliwe jest jedynie w wysoko wyspecjalizowanych ośrodkach, dysponujących odpowiednim przygotowaniem i sprzętem.
Najistotniejsze etapy ICSI obejmują uzyskanie i przygotowanie nasienia, przygotowanie komórki jajowej i wykonanie mikroiniekcji, specjalnie przygotowanymi narzędziami.
Uzyskanie nasienia
Nasienie uzyskuje się zazwyczaj drogą masturbacji, równolegle do pobrania komórek jajowych partnerki. Po 20 min wykonuje się ocenę seminologiczną i kwalifikuje się do specyficznej preparatyki. Należy w tym miejscu stwierdzić, iż w trakcie leczenia zaawansowanymi technikami wspomaganego rozrodu, dosyć często pojawiają się problemy z uzyskaniem nasienia lub też z brakiem plemników w nasieniu czy też brakiem żywych plemników u pacjentów u których wcześniej były one obecne. Jest to bardzo stresowa sytuacja zarówno dla zespołu leczącego jak i pacjentów, dlatego racjonalne jest wcześniejsze zdeponowanie nasienia w „banku” co daje pewność, że gamety są dostępne na „żądanie”. W tej sytuacji uzyskanie nasienia świeżego jest mniej stresogenne a ejakulat ma zazwyczaj lepszą jakość. Nie jest to jedyny powód uzasadniający wykorzystanie technik kriokonserwacyjnych w leczeniu niepłodności. Inne możliwości, to gromadzenie kolejnych ejakulatów od pacjentów z ciężką oligospermią, kryptospermią, asthenospermią czy nekrospermią (pooling) z późniejszym ich wykorzystaniem dla potrzeb ICSI. W przypadku pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, wstecznym wytryskiem nasienia, zaburzeniami wzwodu i ejakulacji oraz u tych gdzie uzyskuje się w nasieniu okresowo pojedyncze plemniki kriokonserwacja stwarza unikalną szansę skutecznego leczenia. Zmniejsza również do minimum ryzyko braku możliwości wykonania mikroiniekcji pobranych już komórek jajowych. Oddzielny, ważny problem dotyczy przechowywania plemników ekstrahowanych z najądrza lub jądra oraz mrożenie tkanki jądrowej w celu późniejszego odzyskania z niej plemników celem użycia ich dla potrzeb ICSI. Są to metody funkcjonujące na poziomie klinicznym, możliwe do wykorzystania w celu uniknięcia wielokrotnyh biopsji jąder. Wydaje się również, że materiał uzyskany z jąder dla potrzeb diagnostycznych, powinien zostać obligatoryjnie zamrożony.
Inna rola kriokonserwacji w terapii niepłodności małżeńskiej wiąże się z profilaktyką jatrogennej niepłodności mężczyzn. Zachowanie potencjału rozrodczego w obliczu planowanej terapii chemicznej, radiologicznej czy chirurgicznej, które mogą lub uczynią pacjenta niepłodnym, poważnie subfertylnym lub niezdolnym do normalnego życia seksualnego to obowiązek lekarzy prowadzących leczenie. Depozyt nasienia pozwala na uniknięcie ryzyka oddziaływania czynników mutagennych, powodujących liczbowe lub strukturalne aberracje chromosomowe w komórkach spermatogenezy. W wielu przypadkach użycie chemioterapii w leczeniu nowotworów prowadzi do zahamowania (niekiedy nieodwracalnego) spermatogenezy z możliwym zanikiem wyjściowych komórek spermatogenezy. Także w przypadkach leczenia operacyjnego rozległych przepuklin pachwinowych oraz zabiegach na układzie moczo-płciowym mężczyzny, szczególnie obejmującym okolicę szyi pęcherza moczowego, wskazane jest również rozważenie zdeponowania nasienia.
Należy stwierdzić iż utrata płodności przez leczonych pacjentów w omówionych sytuacjach klinicznych może prowadzić do konsekwencji nie tylko zdrowotnych i społecznych ale również roszczeniowych co należy brać pod uwagę szczególnie w obliczu dokonującej się reformy służby zdrowia.
Przygotowanie nasienia
Procedury izolacji plemników w przypadkach oligoasthenoteratospermi, kryptozoospermii czy też nasienia mrożonego, nie odbiegają w sposób istotny od stosowanych powszechnie w technikach wspomaganego rozrodu. Najczęściej wykorzystuje się separację plemników poprzez wirowanie na nieciągłym gradiencie Percollu. W przypadkach stwierdzania pojedynczych plemników w ejakulacie (1-2 plemniki co kilka pól widzenia w ocenie mikroskopowej) zastosowanie preparatyki percollowej wiąże się ze znacznym ryzykiem utraty nielicznych plemników. Przygotowanie plemników ogranicza się wtedy do płukania i odwirowania nasienia oraz zastosowania mikrometody – migracji wstępującej (mini-swim-up), niekiedy wielokrotnej. Szczególne trudności mogą wiązać się z uzyskaniem żywych plemników z ejakulatów pacjentów z nekrospermią oraz ciężką asthenospermią, przy relatywnie dużej ich liczbie. Odnalezienie plemników, o niekiedy bardzo słabych oznakach aktywności życiowej, związane jest z długotrwałym poszukiwaniem i może wymagać zastosowania wstępnej procedury odzysku przy pomocy mikromanipulatorów („hunting”).
Przygotowanie komórki jajowej
Przed przystąpieniem do mikrochirurgicznego zapłodnienia oocyt powinien być pozbawiony otaczających go komórek wzgórka jajonośnego i wieńca promienistego. Odbywa się to przy pomocy enzymatycznych i mechanicznych zabiegów, wykonywanych w stałej temperaturze 37°C, w podłożach hodowlanych pod sterylną, płynną parafiną. Pozbawione struktur wieńca promienistego i wzgórka jajonośnego komórki jajowe są wielokrotnie płukane podłożem Earle'a buforowanego HEPES-em z dodatkiem wysokiej jakości surowic. W razie konieczności odroczenia mikroiniekcji oocyty są przechowywane w podłożu hodowlanym Menezo B2 do czasu zabiegu. Uzyskane w ten sposób komórki jajowe poddawane są ocenie mikroskopowej. Potwierdzenie nienaruszonej struktury komórki oraz obecność pierwszego ciałka kierunkowego pozwala zakwalifikować oocyt jako dojrzały i poddać go dalszym procedurom. Ocenia się, że ponad 80% pobranych komórek, to oocyty na etapie metafazy II, pozostałe komórki jajowe mogą znajdować się na etapie germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD) oraz metafazy I. Te ostatnie, mają szansę na zakończenie dojrzewania in vitro, szczególnie w kokulturze z komórkami Vero. W pełni dojrzałe oocyty umieszczane są w mikrokropli podłoża hodowlanego – zazwyczaj Earle'a buforowanego HEPESEM, pod przykryciem oleju mineralnego i poddawane mikroin-iekcji.
Przygotowanie mikronarzędzi
Istotnym etapem przygotowawczym do ICSI jest wykonanie mikrochirurgicznych narzędzi, niezbędnych do wykonania tego zabiegu. Może to odbywać się tylko w profesjonalnie przygotowanych pracowniach, wyposażonych w odpowiedni sprzęt. Pipety iniekcyjne i przytrzymujące powinny być wykonane z nietoksycznego szkła, posiadającego odpowiednie i stałe właściwości fizyczne. Uzyskanie pipet o zakładanej zewnętrznej i wewnętrznej średnicy oraz odpowiednio ukształtowanym zakończeniu możliwe jest poprzez wyciąganie, obtapianie i szlifowanie ich przy użyciu specjalnego oprzyrządowania.
Wykonanie zabiegu ICSI
Zabieg ICSI odbywa się pod bezpośrednią kontrolą obrazu mikroskopowego, bądź przy użyciu systemów wizyjnych i obserwacji procedury na monitorze. Wskazane jest użycie kontrastu modulacyjnego Hoffmana, co zapewnia doskonałą jakość obrazu, umożliwiającą precyzyjną oceną oocytów, plemników i pozycji mikronarzędzi wobec gamet, jak również ułatwia pracę dzięki dużej odległości kondensora od pola operacyjnego. Niezbędnym elementem wyposażenia mikroskopu są mikromanipulatory umożliwiające precyzyjne posługiwanie się mikronarzędziami. Środowisko, w jakim przeprowadzany jest zabieg ICSI, stanowią mikrokrople z oocytami oraz oddzielne krople z przygotowanymi wcześniej plemnikami. Zwiększenie gęstości środowiska poprzez dodanie poliwinylopirolidonu (PVP), umożliwia spowolnienie ruchu plemników ułatwiając unieruchomienie plemnika poprzez mechaniczne uszkodzenie witki i wprowadzenie go do pipety iniekcyjnej. Stałość warunków w podłożu zapewnia odpowiednie buforowanie, umieszczenie kropli pod parafiną oraz używanie stolika o kontrolowanej i stałej temperaturze.
Wybrane plemniki o najlepszych parametrach morfologicznych są unieruchamiane poprzez mechaniczne złamanie witki. Można to osiągnąć dociskając witkę pipetą iniekcyjną do dna płytki hodowlanej, bądź też za pomocą gwałtownego uderzenia pipety kontrolowanej przez urządzenie piezoelektryczne. Pojedyncze plemniki wprowadzane są do pipety iniekcyjnej z minimalną objętością podłoża 10-15 µl.
Komórka jajowa unieruchomiona ujemnym ciśnieniem wytwarzanym w pipecie przytrzymującej, powinna być ustawiona ciałkiem kierunkowym na godzinie 6 lub 12, a punkt jej nakłucia na godz. 3, przy skierowaniu otworu pipety iniekcyjnej w odwrotną stronę w stosunku do ciałka kierunkowego. Taka technika zmniejsza prawdopodobieństwo uszkodzenia wrzeciona kariokinetycznego oocytu w trakcie jego nakłucia. Wstrzyknięcie pojedynczego plemnika do cytoplazmy odbywa się po przerwaniu ciągłości zarówno otoczki przejrzystej, jak i oolemmy. Po zabiegu komórki umieszczane są w płynie hodowlanym, a dalszy sposób postępowania jest identyczny jak w przypadku standardowego pozaustrojowego zapłodnienia. Wyniki uzyskiwane przez Van Steirteghema i wsp. dowodzą, że metoda ta cechuje się wysoką wydajnością. Prawie 90% nakłutych oocytów nie wykazuje cech uszkodzenia struktur komórkowych. Odsetek zapłodnionych prawidłowo komórek jajowych przekracza 50-60% ogólnej liczby nakłuwanych oocytów, podczas gdy liczba nieprawidłowo zapłodnionych nie przekracza kilku procent. Podobne wyniki uzyskują Kuczyński i wsp. z Kliniki Ginekologii Instytutu Położnictwa i Chorób kobiecych Akademii Medycznej w Białymstoku.
Całkowity brak zapłodnień po zastosowaniu ICSI, w ośrodkach o odpowiednim doświadczeniu nie przekracza 3%, a przypadki o niewyjaśnionej etiologii niepowodzenia występują nie częściej niż 0,3%. Całkowity brak zapłodnień obserwuje się w przypadkach, kiedy nakłuwane są pojedyncze oocyty, w nasieniu nie stwierdza się ruchomych plemników, uzyskane oocyty wykazują cechy degeneracji, bądź też kiedy wszystkie oocyty zostają uszkodzone w trakcie zabiegu. Niepowodzenia o typie poliploidii, często spotykane w komórkach zapłodnionych innymi technikami mikrochirurgicznego zapłodnienia, w przypadku ICSI nie stanowią znaczącego problemu i są najczęściej wynikiem braku wyrzucenia II ciałka kierunkowego.
Kliniczne wyniki leczenia niepłodności męskiej tą metodą są bardzo zachęcające. Według Van Steirteghema i wsp. odsetek ciąż uzyskanych w wyniku docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika przekracza 34% w przeliczeniu na cykl. Podobne wyniki uzyskiwane są przez zespół białostocki. Wskaźniki ciąż w przeliczeniu na cykl wynoszą od 25 do 44% i zależą od wieku pacjentek, jakości odpowiedzi jajników na leki oraz zastosowanego przygotowania pacjentów i nasienia.
Głęboka ingerencja w proces zapłodnienia zmusza do szczególnej uwagi w ocenie ewentualnego, niekorzystnego wpływu na zdrowie dzieci urodzonych w wyniku zastosowania tej metody. W klinicznym materiale autorów belgijskich, na 1160 ciąż uzyskanych w wyniku ICSI stwierdzono w 6 przypadkach anomalie chromosomalne, a na 699 urodzonych dzieci u 18 (2,7%) stwierdzono wady wrodzone. Odsetek wad nie różni się w sposób istotny statystycznie od występujących w populacji dzieci poczętych w warunkach in vivo, bądź in vitro bez udziału mikromanipulacji.
Pojawiły się pewne problemy bioetyczne związane ze stosowaniem ICSI. Dyskutuje się możliwość potencjalnego ryzyka przenoszenia z pokolenia na pokolenie chorób warunkowanych genetycznie, a także zwiększone ryzyko wprowadzenia heterogenicznego oraz uszkodzonego DNA, pochodzących z nieprawidłowych plemników. W chwili obecnej badania genetyczne przeprowadzone wśród potomstwa uzyskanego za pomocą mikromanipulacji nie wykazały zwiększonej częstości takich powikłań. Wydaje się, że mechanizmy wytworzone w toku ewolucji mające za zadanie ochronę i naprawę uszkodzonego DNA (np.: wiele kopii tych samych genów w łańcuchu DNA, koniugacja chromosomów) są wydolne na tyle, że eliminują ew. zagrożenia o jakich mowa.
Potencjalne zagrożenia związane ze stosowaniem technik mikrochirurgicznych nakazują prowadzenie stałej, na wysokim poziomie, kontroli jakości. Wyniki powinny być odnoszone do analogicznych w równolegle funkcjonującym klasycznym programie pozaustrojowego zapłodnienia. Stąd też wielu autorów uważa, że technologia ta powinna być wykorzystywana jedynie przez duże ośrodki leczenia niepłodności, dysponujące odpowiednim poziomem diagnostyki andrologicznej i genetycznej.
Mikrochirurgiczna aspiracja plemników z najądrzy (micro-epidydymal sperm aspiration – MESA)
W grupie mężczyzn z azoospermią, której przyczyną jest brak bądź niedrożność nasieniowodów, szansę na uzyskanie potomstwa stwarza opisana przez Ascha i Silbera technika uzyskiwania plemników poprzez mikrochirurgiczną aspirację plemników z najądrza (MESA). Plemniki uzyskiwane z najądrzy są stosowane zarówno w standardowej technice IVF, jak i mogą być przenoszone wraz z oocytami do jajowodów. Skuteczność tych technik pozostaje jednak dyskusyjna. Problem braku dojrzałości czynnościowej plemników najądrzowych może być skutecznie rozwiązany jedynie przy wykorzystaniu mikrochirurgicznych technik zapłodnienia. Uzyskiwane wyniki MESA nie odbiegają zasadniczo od wyników ICSI wykonywanej plemnikami pochodzącymi z nasienia. W grupie pacjentów z wrodzonym brakiem nasieniowodów uzyskuje się 22% ciąż w przeliczeniu na cykl, a średni odsetek dzieci urodzonych przekroczył 16%.
Izolacja plemników jądrowych (testicular sperm extraction – TESE), (testicular sperm aspiration – TESA)
W ostatnich latach pojawiła się również szansa na posiadanie własnego potomstwa u par, u których partner obarczony jest azoospermią spowodowaną dysfunkcją kanalików jądrowych. Technika TESE polega na ekstrakcji plemników z materiału uzyskanego w trakcie biopsji jądra, natomiast TESA pozwala na uzyskanie pojedynczych plemników z tkanki jądrowej uzyskanej w wyniku biopsji igłowej jądra. Wyizolowane przy pomocy mikromanipulatorów plemniki, są wstrzykiwane do komórek jajowych w sposób identyczny jak przy ICSI. Według Silbera i wsp. u około 60% par po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika jądrowego dochodzi do zapłodnienia a w około 30% uzyskuje się ciążę. Wyniki te są zbliżone do uzyskiwanych w przypadkach zastosowania technik mikrochirurgicznych zapłodnienia z wykorzystaniem plemników izolowanych z nasienia. Są już pierwsze doniesienia o urodzeniu dziecka po iniekcji do komórki jajowej spermatydy uzyskanej z jądra, a nawet mikroiniekcji gołych jąder spermatyd (ROSNI). Doniesienia te są dowodem na możliwość uzyskania ciąży przy udziale komórki prekursorowej o haploidalnej liczbie chromosomów. Należy stwierdzić, że zapłodnienie komórkami prekursorowymi lub niedojrzałymi plemnikami wiąże się ze szczególnym ryzykiem zaburzeń rozwojowych, związanych z nieprawidłową funkcją genów warunkujących rozwój somatyczny płodu (genomic imprinting).
 
Piśmiennictwo
1. Adashi E.Y. et al.: Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology Lippincott. Raven Philadelphia New York, 1995. 2. Cohen J. et al.: Micromanipulation in Clinical Menagement of Fertility Disorders. Sem. Reprod. Endcrinol. 1994; 12:3. 3. Edwards R.G.: Conception in the Human Female. Akademic Press London UK 1980. 4. Edwards R.G. Brody S.: Principles and practice of Assisted Human Reproduction. [W] B. Saunders. Philadelphia PA USA 1995. 5. Matthews C.D.: Microassisted fertilization in assisted conception: indications and patient impact. Bailliere's Clin. Obstet. Gynecol. 1994; 8:1. 6. Palermo G.D, Rosenwaks Z.: Assisted Fertilization for Male-Factor Infertility. Sem. Reprod. Endocrinol. 1995; 13:1. 7. Wood C., Trounson A.: O Clinical in vitro Fertilization. Springer – Verlag Berlin New York 1988. 8. Van Steirteghem A. et al.: Intracytoplasmic sperm Injection. Bailliere's Clin. Obstet. Gynecol. 1994; 8:1.
 
żródło: Nowa Medycyna - Ginekologia VII http://www.borgis.pl/czytelnia/nm_ginekolo/18.html
wpisz("nm_text.html", "Nowa Medycyna", "Ginekologia VII (6/1999)");

0
Twoja ocena: Brak

Odpowiedzi

Portret użytkownika denisdesign

Re: emakurzoie

cheap generic viagra [www.cikmedia.com] compare viagra cialis levitra online viagra [www.cikmedia.com] levitra cialis compare buy levitra online us [www.curling.no] cialis generic lowest price viagra cheap online levitra [www.incent.no] buying cialis online testimonials levitra [www.curling.no] buy cheap cialis levitrabuy cheap levitra online [www.eikedalen.no] generic name viagra viagra to buy cheap [www.incent.no] buy viagra online cheap buy viagra [www.cikmedia.com] by levitra posted levitra for woman [www.curling.no] best price for viagra viagra for sale without a prescription [www.cikmedia.com] viagra uk without prescription where to buy viagra online [www.eikedalen.no] buy cialis without a perscription book buy online order viagra [www.curling.no] 50mg generic cialis purchase levitra online [www.nettxtra.no] cialis online cyalis online levitra [www.incent.no] the buy cialis cialis for women [www.curling.no] viagra cialis levitra sale levitra [www.eikedalen.no] cialis 10 mg online pharmacy free shipping levitra [www.nettxtra.no] comparison study of viagra cialis levitra buy viagra prescription online [www.nettxtra.no] cialis versus viagra by levitra posted [www.cikmedia.com] is generic cialis available buy levitra now [www.eikedalen.no] viagra levitra studies

Portret użytkownika denisdesign

Re: hbaip

lowest price levitra generic online [forum.envyme.us] buy levitra online viagra cialis levitra sale viagra [www.oeffinger.com] generic levitra cialis levitra viagra [festizioguild.com] discount levitra online levitrabuy levitra online [www.mixologist.co.uk] buy cheap levitra online generic levitra pill [www.stopdrafting.com] levitra for sale levitra online us [www.vbccossonay.com] cialis levitra viagra levitra generic [www.tenacity-guild.org] information on the price of levitra levitra pills [borakbola.net] levitra com levitra discount [www.yartrans.com] cialis and levitra levitra cialis [www.southafrica.me] cialis levitra online levitra discount [www.yartrans.com] kaufen levitra generic levitra cheap [www.gchs-fbla.org] viagra cialis levitra levitra cheap [www.tacticstc.com] online levitra levitra for sale [www.saw-sl.com] buy levitra online us cheap online levitra [zvcstudios.site88.net] canadian pharmacy and levitra cheap levitra [www.tptk.ru] levitra side effects compare cialis levitra [www.deliversavings.com] where to buy levitra generic levitra [forums.io-guild.net] cialis and levitra levitra viagra [networkpro.co.cc] buy levitra in europe looking for levitra [www.jeepyweepy.com] buy levitra online us

Portret użytkownika denisdesign

Re: ehiujyle

cialis buy [www.midwestcagesport.com] cialis for women buy cheap generic cialis [www.nultz.biz] purchase cheap cialis online buying cialis online [www.chempository.com] cialis and online pharmacy no prescription needed cialis [www.arizonaelks.org] prices online cialis buy cheapest cialis [www.uswar.com] viagra cialis online cialis professional [www.jus4him.com] cialis viagra cialis levitra generic 10mg cialis [stutteringcure.net] compare cialis levitra the buy cialis [www.ndsls.org] levitra cialis generic cialis soft tabs [marketamericanews.com] cialis levitra versus cialis and online prescription [www.vertexgaming.com] cialis levitra viagra vs vs cialis cheapest [www.well-come.be] viagra cialis online the buy cialis [www.ndsls.org] cialis generic pharmacy cialis levitra viagra vs vs [forum.pnijobs.com] buying cialis online viagra cialis levitra [www.nosheep.co.uk] cialis online cyalis cialis comparison levitra viagra [forum.kuchingscuba.com] cialis and diabetes cialis buy [www.midwestcagesport.com] levitra and cialis buying cialis online [www.chempository.com] viagra cialis online is generic cialis available [www.epidemic-guild.org] cialis new viagra buy cialis with paypal [karmicdebt.net] the buy cialis prices online cialis [www.journalforums.com] generic 10mg cialis

Portret użytkownika denisdesign

Re: euieyva

buy cialis online now [www.globewomen.org] levitra vs viagra levitra onlines [www.globewomen.org] viagra cialis levitra viagra cheap online [www.globewomen.org] effects of levitra cialis without prescription [www.globewomen.org] by levitra posted how to buy cialis [www.cseb-scbe.org] levitra best price buy viagra cialis levitra [www.globewomen.org] generic cialis without a perscription cialis without prescription [www.globewomen.org] viagra uk female viagra [www.globewomen.org] where to buy cialis levitra online us [www.cseb-scbe.org] viagra buy online free viagra [www.cseb-scbe.org] free viagra in the uk cialis generic lowest price viagra [www.cseb-scbe.org] generic cialis from india cialis levitra viagra vs vs [www.globewomen.org] buy cheap viagra generic levitra pill [www.globewomen.org] viagra cialis generic cialis [www.cseb-scbe.org] free samples of cialis cheap no prescription viagra [www.cseb-scbe.org] cialis levitra viagra vs vs levitra vs viagra [www.globewomen.org] cialis levitra viagra compare generic cialis from india [www.globewomen.org] how to buy cialis levitra side effect [www.cseb-scbe.org] levitra buy where to buy levitra [www.cseb-scbe.org] where can i buy viagra in england cialischeap cialis online [www.cseb-scbe.org] buy low price viagra

Portret użytkownika denisdesign

Re: xacqkto

viagra cialis generica [www.hugeimage.com] buy cheap viagra online online pharmacy generic cialis [www.pimpmymallet.com] buy en language levitra generic viagra online [www.cdkinfo.com] cheap viagra levitra en mexico [www.porthenry.net] viagra to buy levitra cialis [www.pimpmymallet.com] generic levitra pill where to buy viagra [www.cdkinfo.com] mail order levitra buy generic online viagra [www.cdkinfo.com] levitra cialis comparison buy cialis online [www.hugeimage.com] buying viagra online compare cialis online [www.hugeimage.com] where can i buy cheap cialis levitrabuy levitra online [www.crdpa-bnu.org] online viagra levitra online us [www.crdpa-bnu.org] cialis cheap free generic cialis [www.pimpmymallet.com] buy cheapest viagra buy en language levitra [www.crdpa-bnu.org] buy cheap levitra online prices online cialis [www.pimpmymallet.com] levitrabuy cheap levitra online the buy cialis [www.hugeimage.com] order viagra online buy levitra [www.porthenry.net] cialis levitra discount cialis generic [www.hugeimage.com] buy cialis online now buy levitra us [www.crdpa-bnu.org] order cheap levitra buy viagra online in uk [www.cdkinfo.com] buy levitra where cialis comparison levitra viagra [www.porthenry.net] cialis for women

Portret użytkownika denisdesign

Re: lijew

buy viagra on line [www.mainmanx.com] where can i buy cialis in the uk generic viagra [www.blipsfit.com] cialis levitra viagra vs vs viagra levitra cialis [www.crawlingwithkings.com] lowest price cialis best price for viagra [www.datalinkcorporation.com] levitra discount compare cialis online [www.accesssource.net] cheapest generic viagra cialis new viagra [www.papillonpath.com] what is levitra generic 10mg cialis [www.papillonpath.com] buy generic online viagra buy viagra cheap [www.datalinkcorporation.com] levitra for woman buy cialis without a perscription [www.accesssource.net] viagra cialis compare cialis levitra [www.accesssource.net] viagra cialis levitra mail order levitra [www.crawlingwithkings.com] levitra and cialis viagra where to buy in the united kingdom [www.mainmanx.com] buy cialis generic viagra lowest prices [www.blipsfit.com] keywords buy viagra online pharmacy generic cialis [www.accesssource.net] generic cheap cialis levitra online [www.alien8ent.com] buy viagra onlines order cheap levitra [www.alien8ent.com] viagra generic cialis vs levitra vs viagra [www.sexstadium.com] generic viagra viagra levitra studies [www.blipsfit.com] online pharmacy generic cialis cialis levitra [www.webdesignassoc.com] viagra cialis prescription online viagra [www.mainmanx.com] where can i buy viagra

Portret użytkownika denisdesign

Re: qokem

cialis viagra [www.healthestarts.com] buy cheap generic cialis cialis and online pharmacy [www.healthestarts.com] viagra cialis prescription online getting an online prescription for cialis [www.hesterhouse.org] discount viagra levitra now online [www.webmei.org] the buy levitra stories on levitra [www.wkveurne.org] looking for levitra buy levitra in europe [www.wkveurne.org] buy en language levitra cialis viagra cialis levitra [www.diablored.com] viagra on line pharmacy cheap no prescription viagra [www.said-education.com] cialis levitra viagra viagra cialis online [www.healthestarts.com] online prescription for levitra us levitra online us [www.wkveurne.org] is generic levitra safe cheap viagra without prescription [www.diablored.com] compare cialis online buy online cialis [www.healthestarts.com] buy low price viagra cheap viagra pills [www.diablored.com] cheap viagra pill cialis new viagra [www.hesterhouse.org] buy overseas viagra viagra cialis levitra comparison [www.hesterhouse.org] levitrabuy levitra online where can i buy viagra in england [www.tecmo-bowl.com] buy levitra online viagra where can i buy viagra [www.diablored.com] lowest prices for cialis levitra discount [www.wkveurne.org] getting an online prescription for cialis to buy viagra how [www.diablored.com] compare cialis levitra generic cialis soft tabs [www.hesterhouse.org] levitra generic cialis

Portret użytkownika denisdesign

Re: bucmdvtkouo

prices online cialis [www.fmr2009.com] lavitra livitra levitra cheap online levitra [www.indianpremiercricketleague.com] cialis cheap cialis online to buy viagra how [www.jspolympus.com] comparison of viagra cielis levitra compare cialis levitra [www.fmr2009.com] online cialis buy levitra now [www.indianpremiercricketleague.com] generic cialis from india cialis comparison levitra viagra [www.audubontravel.com] book buy online order viagra levitra side effect [www.indianpremiercricketleague.com] buy levitra online viagra how to buy viagra [www.audubontravel.com] generic cialis viagra cialis generica [www.audubontravel.com] levitra over the counter cialis professional [www.e-miguel.com] buy cheap online viagra cialis levitra versus [www.e-miguel.com] buy generic online viagra generic cialis soft tabs [www.e-miguel.com] cialis buy cheap cheapest cialis without prescription [www.fmr2009.com] levitra viagra no prescription viagra [www.audubontravel.com] levitra side effects cialis comparison levitra viagra [www.audubontravel.com] buy viagra onlines levitra now online [www.indianpremiercricketleague.com] levitra side effects buy cialis without a perscription [www.fmr2009.com] levitra and cialis viagra cialis levitra [www.audubontravel.com] stories on levitra levitra viagra [www.audubontravel.com] buy viagra here in the uk buy cialis without a perscription [www.fmr2009.com] buy viagra onlines

Portret użytkownika denisdesign

Re: nliyqsiupb

buy cialis where [www.fmr2009.com] free samples of cialis viagra for sale without a prescription [www.jspolympus.com] cheap viagra from pfizer cheap viagra pill [www.audubontravel.com] cheap viagra pills buy viagra online in uk [www.jspolympus.com] levitra for women no prescription viagra [www.jspolympus.com] buy cheapest viagra online viagra [www.jspolympus.com] discount levitra online buy generic viagra [www.jspolympus.com] cialis viagra cialis levitra viagra buy online [www.jspolympus.com] viagra cialis generica viagra cialis [www.audubontravel.com] information on the price of levitra compare cialis levitra viagra [www.fmr2009.com] viagra mail order uk buy cheap levitra online [www.indianpremiercricketleague.com] cheapest generic viagra cialis viagra [www.e-miguel.com] no prescription viagra buy viagra online cheap [www.audubontravel.com] viagra without a prescription buy cheap viagra in uk [www.jspolympus.com] cialis levitra viagra compare generic cialis [www.e-miguel.com] review generic levitra levitra generic cialis [www.indianpremiercricketleague.com] cheap viagra without prescription dysfunction erectile levitra [www.indianpremiercricketleague.com] cialis 10 mg viagra generic [www.jspolympus.com] order cheap levitra cialis and online consultation [www.fmr2009.com] purchase cheap cialis online cheapest place buy viagra online [www.audubontravel.com] levitra samples

Portret użytkownika denisdesign

Re: nuncxfrivi

viagra generic [www.fetesmaritimes.com] the buy cialis viagra cialis online [www.notesonvirginia.com] levitra en mexico levitra cialis compare [www.notesonvirginia.com] levitra versus viagra buy no prior viagra cialis levitra [www.audioknob.com] paypal cialis viagra cialis levitra comparison [www.copops.org] levitra versus viagra viagra cialis [fetesmaritimes.com] viagra for sale without a prescription review generic levitra [www.dublinas.com] buying viagra buy viagra online and get prescription [fetesmaritimes.com] cialis viagra buy online viagra [www.fetesmaritimes.com] buy low price viagra buy levitra now [www.dublinas.com] viagra cheap less no prescription viagra [fetesmaritimes.com] cialis generic purchase viagra levitra [www.dublinas.com] cialis levitra viagra levitra cialis comparison [www.dublinas.com] cialis online pharmacy free shipping levitra [www.dublinas.com] cialis generic lowest price viagra cheapest viagra to buy online in uk [www.fetesmaritimes.com] kaufen levitra cialis generic cheapest [www.copops.org] generic cialis without a perscription when will cialis become generic [www.notesonvirginia.com] online prescription for levitra us viagra cialis [fetesmaritimes.com] best levitra online price buy viagra online and get prescription [fetesmaritimes.com] levitra side effects levitra for woman [www.dublinas.com] buy cialis where

Portret użytkownika denisdesign

Re: uaobz

no prescription needed cialis [www.notesonvirginia.com] cheap viagra pill cheap source viagra [www.audioknob.com] cheap viagra from pfizer viagra or levitra [www.audioknob.com] online viagra cheap viagra online [www.audioknob.com] book buy online order viagra online cialis [www.notesonvirginia.com] cheap source viagra buy viagra online in [www.audioknob.com] buying viagra online cheap viagra pills [www.fetesmaritimes.com] buy levitra where compare cialis levitra [www.notesonvirginia.com] cialis comparison levitra viagra viagra levitra cialis [www.dublinas.com] compare cialis levitra viagra buy cheap online viagra [www.audioknob.com] viagra cialis levitra comparison buy discount online viagra [fetesmaritimes.com] viagra on line generic cialis pill [www.notesonvirginia.com] female viagra order viagra online [www.audioknob.com] levitrabuy cheap levitra online viagra cialis online [www.copops.org] drug testing levitra 50mg generic cialis [www.notesonvirginia.com] buy cheapest cialis viagra cialis levitra comparison [www.fetesmaritimes.com] lowest price levitra generic online buy viagra here in the uk [www.audioknob.com] cialis buy cheap cheapest where to buy viagra [www.fetesmaritimes.com] buy cheap viagra online buy levitra online viagra [fetesmaritimes.com] cialis and online prescription compare cialis levitra [www.notesonvirginia.com] buying viagra online

Portret użytkownika petetongue

Re: tmru

review generic levitra [www.paloaltohomeforeclosures.com] buy cialis online now cialis cheap [www.reo09.com] viagra levitra studies buy levitra online viagra [www.trenchreynolds.com] levitra drug buy viagra prescription online [www.artofmentalwarfare.com] where can i buy viagra in england buy cialis with paypal [www.reo09.com] where to buy viagra online generic viagra online [www.artofmentalwarfare.com] buy cheap viagra in uk buy viagra cheap [www.artofmentalwarfare.com] buy cialis without a prescription viagra levitra [www.paloaltohomeforeclosures.com] generic cialis soft tabs dysfunction erectile levitra [www.paloaltohomeforeclosures.com] results viagra cialis levitra compare cialis online [www.angelaalegna.com] buy viagra online in uk buy cheapest cialis [www.reo09.com] levitra cheap cialis [www.angelaalegna.com] comparison study of viagra cialis levitra viagra levitra [www.paloaltohomeforeclosures.com] viagra on line levitra pills [www.paloaltohomeforeclosures.com] buy viagra onlines viagra online buy [www.trenchreynolds.com] viagra cheap online viagra levitra cialis comparison [www.angelaalegna.com] cialis viagra levitra commercial [www.paloaltohomeforeclosures.com] viagra cheap viagra without prescription [www.artofmentalwarfare.com] looking for levitra viagra [www.trenchreynolds.com] cialis generic purchase the buy levitra [www.paloaltohomeforeclosures.com] levitra cialis

Portret użytkownika petetongue

Re: eeanix

purchase levitra [www.brahead.com] buy viagra buy viagra online [www.coasterinsider.com] buy viagra online buy levitra [www.brahead.com] purchase cialis purchase levitra [www.brahead.com] purchase levitra order viagra [www.coasterinsider.com] buy cialis online buy cialis [www.cjraymer.com] purchase levitra [www.coasterinsider.com] buy cialis purchase viagra [www.coasterinsider.com] order cialis order levitra [www.brahead.com] order viagra online order viagra online [www.coasterinsider.com] buy viagra [www.coasterinsider.com] purchase viagra purchase viagra [www.coasterinsider.com] purchase levitra purchase levitra [www.brahead.com] buy levitra online order levitra [www.brahead.com] buy levitra buy levitra [www.brahead.com] purchase levitra purchase viagra [www.coasterinsider.com] order cialis online purchase viagra [www.coasterinsider.com] buy viagra online buy cialis [www.cjraymer.com] buy viagra order levitra online [www.brahead.com] buy viagra online purchase viagra [www.coasterinsider.com] buy levitra

Portret użytkownika petetongue

Re: iirubuouiey

order viagra online [www.coasterinsider.com] buy viagra online order viagra [www.coasterinsider.com] buy levitra online order cialis online [www.cjraymer.com] purchase levitra buy levitra online [www.brahead.com] buy viagra online buy levitra online [www.brahead.com] order levitra buy viagra online [www.coasterinsider.com] buy cialis online buy levitra [www.brahead.com] buy cialis online buy levitra [www.brahead.com] buy levitra online purchase cialis [www.cjraymer.com] buy levitra order viagra online [www.coasterinsider.com] buy viagra purchase viagra [www.dimebagradio.com] buy viagra buy viagra online [www.coasterinsider.com] order cialis online order viagra online [www.coasterinsider.com] purchase cialis order levitra online [www.brahead.com] buy cialis purchase levitra [www.brahead.com] buy viagra [www.dimebagradio.com] purchase viagra order levitra [www.brahead.com] purchase cialis order levitra online [www.brahead.com] buy levitra order cialis [www.cjraymer.com] buy viagra online [www.coasterinsider.com] buy cialis

Portret użytkownika petetongue

Re: tqzbvis

purchase levitra [www.kevin-hebb.com] order levitra buy viagra online [www.nodub.com] purchase levitra order viagra [www.denverexcellentschools.org] order cialis purchase cialis [www.audionovamusic.com] purchase cialis order levitra [www.kevin-hebb.com] buy cialis buy viagra [www.puska.org] buy cialis purchase levitra [www.kevin-hebb.com] buy cialis buy viagra [www.puska.org] order viagra online order cialis [www.rosanelpugno.info] order viagra order viagra online [www.puska.org] order levitra online purchase levitra [www.kevin-hebb.com] order cialis order cialis [www.rosanelpugno.info] order levitra online purchase viagra [www.linuxayuda.org] purchase cialis purchase cialis [www.audionovamusic.com] purchase levitra order viagra [www.denverexcellentschools.org] purchase levitra purchase cialis [www.audionovamusic.com] buy cialis online purchase cialis [www.audionovamusic.com] order levitra online buy viagra online [www.nodub.com] purchase levitra purchase cialis [www.audionovamusic.com] buy cialis buy cialis online [www.rosanelpugno.info] order cialis

Portret użytkownika petetongue

Re: whoq

order viagra online [www.denverexcellentschools.org] purchase viagra buy levitra [www.kevin-hebb.com] order levitra online purchase levitra [www.theraphype.com] order levitra online [www.linuxayuda.org] order levitra order levitra [www.kevin-hebb.com] order viagra online buy cialis [www.thehouseofrock.net] buy viagra purchase levitra [www.theraphype.com] buy viagra buy viagra [www.botoxkerry.com] purchase levitra buy cialis online [www.cannedfitness.com] buy viagra buy viagra online [www.denverexcellentschools.org] order cialis [www.cannedfitness.com] order levitra online [www.theraphype.com] buy levitra online [www.linuxayuda.org] purchase cialis [www.audionovamusic.com] purchase levitra purchase cialis [www.audionovamusic.com] buy levitra online buy levitra [www.kevin-hebb.com] purchase viagra buy cialis [www.thehouseofrock.net] buy levitra buy cialis online [www.cannedfitness.com] buy cialis purchase cialis [www.audionovamusic.com] order viagra online buy viagra [www.botoxkerry.com] purchase viagra